Wie kann man COVID-19 schnell und einfach erkennen? Eine neue Methode macht es möglich!
Die weltweite Ausbreitung von COVID-19, verursacht durch das Coronavirus SARS-CoV-2, hat zu schweren Lungenentzündungen und Atemwegserkrankungen geführt. Während China die Epidemie durch strenge Maßnahmen kontrollieren konnte, steigt die Zahl der Fälle und Todesfälle in anderen Ländern weiter an. SARS-CoV-2 ist deutlich ansteckender als seine Vorgänger, das SARS-CoV und das MERS-CoV. Eine schnelle und genaue Erkennung des Virus ist entscheidend, um die Ausbreitung der Krankheit zu kontrollieren. Derzeit sind Computertomographie und Blutuntersuchungen die ersten Anzeichen für eine COVID-19-Infektion, während der Nachweis von Virus-Erbgut durch RT-PCR (Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion) der Goldstandard für die klinische Diagnose ist. Allerdings ist RT-PCR zeitaufwendig, erfordert spezialisierte Labore und geschultes Personal und ist anfällig für Schwankungen in der Qualität der Proben. Im Gegensatz dazu bietet der Nachweis von spezifischen Antikörpern im Blut mittels eines kolloidalen Gold-Immunochromatographie-Tests (GICA) eine schnelle, hochempfindliche und gerätefreie Alternative, die ideal für Tests vor Ort ist.
Diese Studie zielte darauf ab, effiziente GICA-Testkits für den Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen Antikörpern (IgM und IgG) im Blut von COVID-19-Patienten zu entwickeln. Zwei Arten von Testkits wurden entworfen: Kit A verwendet eine einzige Testlinie, um spezifische IgM- und IgG-Antikörper gegen das N-Protein von SARS-CoV-2 zu erfassen, während Kit B, eine weiterentwickelte Version von Kit A, separate Testlinien für IgG- und IgM-Antikörper aufweist, um zwischen ihnen zu unterscheiden. Beide Kits verwenden kolloidales Gold-markiertes N-Protein von SARS-CoV-2 als Antigen. Für die Kontrolllinie wurden Kaninchen-IgG und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper als Antigen und Antikörper ausgewählt.
Die Entwicklung der GICA-Testkits umfasste die Herstellung von kolloidalem Gold-markiertem N-Protein und Kaninchen-IgG. Kurz gesagt wurden 10 mL einer kolloidalen Goldlösung (40 nm) mit 65 mL Kaliumcarbonat (0,1 mol/L) gemischt. Das rekombinante SARS-CoV-2-N-Protein-Antigen wurde schnell hinzugefügt und die Mischung für 30 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden 100 mL einer 20%igen Rinderserumalbuminlösung hinzugefügt und die Mischung für weitere 30 Minuten inkubiert. Die Mischung wurde bei 12.000 U/min für 20 Minuten zentrifugiert und mit 5 mL Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS; 50 mmol/L, pH 7,4) gewaschen. Der Niederschlag wurde in 1,0 mL kolloidaler Goldpufferlösung gelöst. Das Antigen wurde auf eine Konjugationsmatte aufgetragen und unter spezifischen Druckbedingungen gedruckt. Ebenso wurden Maus-Anti-Human-IgM/IgG-Antikörper und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG-Antikörper mit PBS verdünnt und auf eine Polyvinylchloridfolie mit Nitrocellulose gedruckt. Der bedruckte Film wurde in einem 37°C-Trockenschrank für 6 Stunden getrocknet. Alle vorbereiteten Materialien wurden gemäß dem Designschema zusammengesetzt.
Um die Empfindlichkeit und Spezifität der entwickelten Kits zu bewerten, wurde eine klinische Studie mit Serumproben von 43 bestätigten COVID-19-Patienten und 45 Patienten mit nicht verwandten Krankheiten durchgeführt. Alle Blutproben wurden vom Ersten Affiliierten Krankenhaus und dem Lungenkrankenhaus der Shanxi Medical University, Taiyuan, China, zwischen dem 7. und 20. Februar 2020 gesammelt. Die Studie folgte der Deklaration von Helsinki und wurde vom Ethikausschuss für Humanstudien der Shanxi Medical University genehmigt. Für den Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen Antikörpern wurden 10 mL der Probe auf die Probenmatte gegeben, gefolgt von der Zugabe von 80 mL Verdünnungslösung. Die Testergebnisse wurden qualitativ nach 15 Minuten anhand der Färbung der IgM- und/oder IgG-Linie und der Kontrolllinie bestimmt. Alle Verfahren wurden in einem Labor der Biosicherheitsstufe 3 durchgeführt. Die Interpretation der Testergebnisse war wie folgt: Das Vorhandensein einer sichtbaren Farbe in der Kontrolllinie und der IgM- und/oder IgG-Testlinie zeigt das Vorhandensein von SARS-CoV-2-spezifischen IgM- und/oder IgG-Antikörpern in der Probe an. Wenn nur die Kontrolllinie farbig ist, zeigt dies das Fehlen von IgM- und IgG-Antikörpern an. Keine Farbänderung in der Kontrolllinie bedeutet einen ungültigen Test, möglicherweise aufgrund von schlechter Kit-Qualität oder anderen unbekannten Gründen.
Repräsentative Testergebnisse von Kit B zeigten, dass sichtbare Bänder sowohl in der Nachweislinie als auch in der Kontrolllinie bei COVID-19-Patientenproben, aber nicht in Kontrollproben beobachtet wurden. Tests wurden auch mit einer menschlichen IgG-Monoklonalantikörper-Lösung gegen das Nukleokapsid-Protein von SARS-CoV-2 durchgeführt, und die Ergebnisse wurden durch Western Blot bestätigt. Die Ergebnisse zeigten, dass die Empfindlichkeit von Kit A und Kit B 88,3% bzw. 93,0% betrug, mit einer Spezifität von 100% für beide Kits. Diese Ergebnisse zeigen, dass eine schnelle und genaue Erkennung von SARS-CoV-2-IgG- und IgM-Antikörpern mit den GICA-Kits erreicht werden kann. Die höhere Empfindlichkeit von Kit B ist auf die separat beschichteten Nachweislinien zurückzuführen, die effektiv IgM- oder IgG-Antikörper gegen SARS-CoV-2 erfassen. Um eine Verzerrung durch den Bediener zu minimieren, wurde während des Testprozesses eine Blindmethode angewendet. Alle Blutproben wurden nummeriert und von einem speziellen Manager vor dem Test behandelt, und die Probeninformationen wurden den Bedienern bis zum Abschluss des Tests vertraulich behandelt. Es ist wichtig zu beachten, dass die Empfindlichkeit und Spezifität der Pilotstudie aufgrund der kleinen Stichprobengröße überschätzt werden könnten.
Zusammenfassend hat diese Studie erfolgreich zwei schnelle, empfindliche Testkits für SARS-CoV-2-spezifische IgG- und IgM-Antikörper mit kolloidaler Gold-Immunochromatographie-Technologie entwickelt. Diese Kits haben ein erhebliches Potenzial für die klinische Diagnose und epidemiologische Überwachung von COVID-19. Der schnelle Nachweistest bietet eine praktische Lösung für die rechtzeitige Erkennung des Virus und hilft bei der Kontrolle und Bewältigung der anhaltenden Pandemie.
doi.org/10.1097/CM9.0000000000000922
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